Actuellement, plusieurs nouvelles techniques de modification génétique font l’objet de discussion, pour déterminer si les produits qui en seront issus seront, ou non, réglementés comme les OGM transgéniques. Cet article d’Eric Meunier de la revue inf’OGM nous permet de comprendre certains des risques potentiels liés à la seule mise en œuvre d’une technique de modification génétique, quelle qu’elle soit, sur une culture de cellules végétales.
Les techniques de modification génétique, nouvelles ou anciennes, ne sont pas totalement maîtrisées : si elles permettent d’apporter certains nouveaux caractères à un être vivant (comme la capacité à tolérer un herbicide), elles produisent également de façon non intentionnelle d’autres modifications dénommées « hors-cible » (off-target en anglais) car ayant lieu en d’autres endroits du génome que celui initialement ciblé.
Le 7 avril 2016, comme en écho aux remarques d’Yves Bertheau, ex-membre du Haut Conseil des Biotechnologies (HCB), formulées depuis décembre 2015, Jean-Christophe Pagès, président du Comité Scientifique (CS) du HCB, expliquait à l’Office parlementaire sur l’évaluation des choix scientifiques et techniques (OPECST) à propos d’une de ces nouvelles techniques, Crispr/Cas9, qu’il « faut ne pas oublier quelles sont les difficultés de son application […] en particulier in vivo chez l’animal dans la mesure où il faut apporter une matrice et on a actuellement de gros soucis de vectorisation pour pouvoir le faire.
In vitro, en culture, en revanche, c’est quelque chose de beaucoup plus aisé et c’est la raison pour laquelle la majorité des applications sont des applications de recherche et éventuellement des applications pour lesquelles on peut reconstituer des organismes à partir de culture in vitro, et là ça concerne effectivement certaines plantes »… Des propos qui interpellent car, à y regarder de plus près, l’avis du CS du HCB du 4 février 2016 – devenu depuis rapport provisoire – ne fait pas état de telles difficultés in vivo, ou de telles « facilités » de mise en œuvre in vitro.
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Dans les différentes étapes du processus de modification génétique. Nous allons nous intéresser à l’étape dite de vectorisation qu’évoque Jean-Christophe Pagès, qui consiste à apporter dans une cellule le matériel destiné à générer la modification génétique souhaitée. Mais aussi aux étapes préalables à cette phase de vectorisation qui s’avèrent être sources de stress capables d’induire des mutations et des épimutations (voir encadré ci-dessous).
Mutation, épimutation : de quoi parle-t-on ?
Une mutation est couramment définie comme une modification de l’information génétique contenue dans un organisme, que ce soit sous forme d’ADN ou d’ARN. Les mutations sont héréditaires. Elles peuvent être « silencieuses », c’est-à-dire n’avoir aucune implication dans le métabolisme de l’organisme. Elles peuvent aussi affecter l’expression d’un ou plusieurs gènes, modifiant le métabolisme.
Les épimutations appartiennent à la famille des mutations affectant l’expression d’une séquence génétique mais qui ne sont pas dues à une modification de la séquence génétique elle-même. Elles peuvent par exemple être dues à un changement de la composition chimique de briques de base de l’ADN, les nucléotides.
Préparation des cellules à transformer
La première étape avant de pouvoir introduire du matériel dans des cellules (la vectorisation dont parle J.-C. Pagès) consiste à préparer les cellules végétales. Les techniciens de laboratoire vont casser la paroi des cellules, voire l’enlever complètement. Les cellules végétales dont la paroi a disparu, ou protoplastes, deviennent donc transformables et les biologistes peuvent alors faire entrer toute une panoplie d’outils comme des grosses protéines, des ARN et/ou des ADN codant dans ces cellules. Or, comme le rappelle Yves Bertheau, cette « simple » formation de protoplastes induit des mutations et épimutations, un phénomène abondamment observé dans la littérature scientifique [1].
La simple mise en culture de cellules induit des mutations
La deuxième étape consiste à cultiver ces protoplastes. Or le fait même de mettre en culture des cellules est générateur de mutations et épimutations. Le plus étonnant est qu’une bibliographie scientifique montre que les mécanismes à la base de l’apparition de ces mutations et épimutations restent encore assez méconnus malgré des décennies d’utilisation [2]. Ce phénomène, appelé variation somaclonale, est tel qu’il a d’ailleurs été utilisé par des semenciers pour créer une « diversité génétique » nécessaire pour « améliorer » des plantes, pour reprendre un élément de langage des semenciers.
Le Groupement national des industries semencières (GNIS) explique ainsi que « la variation somaclonale est la modification observée chez certaines cellules, après un long cycle de cultures in vitro sans régénération. Elles ne sont plus alors identiques à la plante mère. Cette variation peut être due à une modification du génome nucléaire ou du génome des organites cytoplasmiques ».
En d’autres termes, les plantes obtenues à partir de ces cellules auront des caractéristiques différentes. Le GNIS apporte une dernière précision intéressante : « les modifications de caractères obtenues sont peu stables et ne se retrouvent pas toujours dans la plante régénérée, ou dans sa descendance ». La raison ? Des modifications apparues (épimutations) peuvent faire disparaître les mutations obtenues [3]… Comme nous l’explique Yves Bertheau, « il paraît difficile dans de telles conditions de prévoir quels impacts peut avoir cette étape de mise en culture de cellules lors de la mise en œuvre d’une nouvelle technique de modification génétique ».
La vectorisation, enfin…
Cellules préparées et mises en cultures, nous voilà enfin prêts à introduire le matériel destiné à générer la modification souhaitée. Selon les techniques, ce matériel peut consister en protéines et/ou séquences génétiques de type ARN ou ADN – molécule plus fréquemment utilisée dans le cas des plantes – codant (oligonucléotides, plasmides, virus…). Les méthodes utilisées pour faire pénétrer ce matériel dans les cellules consistent tout simplement à faire des trous dans les membranes restantes (cytoplasmique et nucléaire) de la cellule. Or, comme nous l’explique Yves Bertheau, faire de tels trous induit, là encore, des mutations et des épimutations [4]. Surtout, le chercheur estime qu’il est impossible de prévoir une grille générale d’appréciation des risques. Car il faut choisir entre plusieurs techniques de vectorisation, entre différents types de matériel, le tout selon les séquences génétiques à introduire et les espèces ciblées. Au final, seule une analyse au cas par cas comme prévu pour les OGM permet d’évaluer les potentiels risques liés à tous ces effets non intentionnels.
Le rapport provisoire du CS du HCB silencieux sur ces mutations
Dans un article publié en 2011, des scientifiques ont estimé que 35% de tous les effets non intentionnels observés suite à une modification génétique de la variété de riz Senia par transgenèse sont dus au processus même de transformation des cellules [5]. Le phénomène n’est donc pas anodin.
Étonnamment, et malgré les déclarations de son Président devant l’OPECST, le comité scientifique du HCB n’a pas fait état de ces risques dans son rapport provisoire sur les risques liés aux nouvelles techniques. Si la question de la « vectorisation » est bien abordée dans les fiches du CS de chaque technique, il s’agit seulement de faire état des moyens de mise en œuvre d’une technique et de décrire comment le matériel est introduit dans les cellules. Nulle part il n’est fait état des mutations et épimutations qui peuvent émerger à chacune des étapes comme nous venons de le voir. Le HCB étant composé d’un comité d’experts scientifiques, on attend de ce comité qu’il discute et explique, pas qu’il ignore ces points. D’autant que la vectorisation – pour ne parler que de ce qui est évoqué dans le rapport du CS – n’apparaît pas complètement au point selon les techniques, le même CS notant ainsi pour la mutagenèse dirigée par oligonucléotides que « de nombreuses molécules ou mélanges moléculaires sont en cours d’essais pour améliorer la vectorisation qui fonctionne relativement bien in vitro mais très peu sur des organismes entiers (Liang et al., 2002) » [6].
Sélectionner et régénérer les cellules « modifiées » n’est pas sans effet
Du fait de leur faible, voire très faible, efficacité de transformation [7], les techniques de modification génétique impliquent en aval de sélectionner les cellules ayant effectivement été modifiées. Cette sélection se fait en utilisant des marqueurs qui permettent de différencier les cellules : gène de résistance à des antibiotiques ou à des herbicides (les cellules sont alors plongées dans un bain d’antibiotiques ou d’herbicides et seules les cellules réellement modifiées survivent), gène qui permet la croissance de la cellule en présence d’une molécule habituellement toxique ou encore gène qui permet aux cellules d’utiliser une source de carbone normalement non métabolisable… ou tout autre marqueur qui sera persistant ou supprimé en bout de course [8]. Mais la suppression de ces marqueurs de sélection se fait par des techniques plus ou moins fiables et précises et qui donc peuvent induire potentiellement des toxicités cellulaires et autres réarrangements chromosomiques [9], laisser des empreintes [10] et produire des sites de recombinaisons (lieux d’échanges de séquence génétique entre deux brins d’ADN) aux effets non prévisibles [11]. Des techniques qui ne sont par ailleurs pas forcément possibles pour toutes les espèces végétales.
À partir de ces cellules sélectionnées, des plantes doivent ensuite être régénérées. Une nouvelle étape de cultures cellulaires qui fera appel à diverses hormones de synthèse, et pourra aussi induire à nouveau des mutations et des épimutations avec réarrangements ou non de chromosomes [12].
Qu’il s’agisse de l’étape de modification génétique en elle-même, des étapes préalables, ou des étapes postérieures, toutes induisent des mutations ou épimutations, appelées effets hors-cible. Mais, on peut entendre dans les couloirs que finalement ces (épi)mutations ne seraient pas présentes dans la plante commercialisée. La raison ? L’étape suivante, dite de rétrocroisement, permettrait de se débarrasser de tous ces effets non intentionnels…
La théorie à la base du rétrocroisement
Rappelons le principe général : une entreprise qui souhaite mettre sur le marché une variété génétiquement modifiée (qu’elle soit légalement considérée comme OGM ou pas) ne va pas modifier directement le génome d’une des variétés « élites » mais celui d’une variété plus commune. Une fois la modification obtenue, l’entreprise va alors croiser une première fois la variété commune génétiquement modifiée (GM) avec la variété élite commercialement intéressante. Elle recroisera ensuite les descendants avec la variété élite initiale jusqu’à ce que ces descendants soient considérés (à partir d’une analyse statistique) quasiment similaires (on parle de variété quasi-isogénique ou de ségrégants négatifs) à la variété élite. La différence entre la variété élite et la nouvelle variété est supposée n’être « quasiment » que la seule séquence modifiée.
Le GNIS explique ainsi que, au dernier croisement, « la part [du génome provenant] de la lignée élite est de 96,88%, on estime alors que la lignée obtenue est suffisamment proche de la lignée élite. On tend vers l’obtention d’une lignée isogénique, ne différant de la lignée élite que par un seul gène [celui contenant la modification] ». On notera ici qu’un pourcentage de 96,88 % laisse encore beaucoup de place aux mutations, épimutations et réarrangements potentiels pour certaines plantes cultivées dont le génome est très grand comme le blé : pour environ 17 milliards de paires de base constituant le génome du blé, les 3,12% restants représentent tout de même plus de 500 millions de paires de bases…
Les limites de la théorie
La théorie sous-jacente au « nettoyage » des effets hors-cible grâce au rétrocroisement se fonde sur l’hypothèse suivante : les effets non intentionnels apparus aux étapes antérieures sont suffisamment éloignés de la région où a eu lieu la modification génétique désirée. En effet, plus ces effets hors cibles sont proches, plus la probabilité est grande que les effets non désirés soient transmis avec la modification génétique à chaque croisement. D’un nombre minimum de sept, le nombre de croisements nécessaires pourrait alors monter à plus de 14 pour essayer de s’en débarrasser.
Mais, outre ce problème de proximité des effets hors cible avec la séquence génétique modifiée, la confiance que l’on peut avoir dans cette théorie est également relativisée par deux autres phénomènes biologiques. D’une part, des séquences génétiques peuvent exister et évoluer en blocs plus ou moins importants. Ces blocs étant transmis tels quels à la descendance, les effets hors-cibles contenus dans ces blocs resteront alors avec la séquence génétique modifiée à chaque croisement. D’autre part, certaines séquences génétiques ont la capacité de « s’imposer » lors de la formation des gamètes. Dites « égoïstes », ces séquences vont être contenues dans un plus grand nombre de gamètes qu’attendu et, de génération en génération, elles seront toujours présentes dans la descendance. Si les effets hors-cible apparaissent dans de telles séquences, il sera moins aisé de s’en débarrasser [13].
Ces éléments impliquent donc qu’une nécessaire vérification au cas par cas paraît nécessaire. A l’heure actuelle, seule la législation sur les plantes transgéniques requiert de telles vérifications au cas par cas avec un ensemble d’analyses le plus complet qu’il soit (avec des déficiences néanmoins rappelons-le). En effet, le séquençage du génome ne permet pas de répondre à la question de la présence ou non d’effets hors-cible du fait des limites inhérentes à ce type d’analyse (cf. encadré ci-dessous).
Le séquençage et les outils informatiques associés ? Tout sauf un gage de certitude !
Le 7 avril, lors de l’audition organisée par l’Office parlementaire sur l’évaluation des choix scientifiques et techniques (OPECST), André Choulika, PDG de Cellectis, affirmait à propos des effets hors-cible « reséquencer intégralement [le génome des plantes], c’est vachement important […] parce que dans l’approbation, on vous redemande la séquence intégrale ». Sauf que, à bien y regarder, les résultats de séquençage obtenus sont loin d’une fiabilité absolue.
Le séquençage dit de « nouvelle génération », est aujourd’hui relativement peu cher et rapide. Mais plusieurs « problèmes » émaillent sa mise en œuvre, la lecture et l’utilisation des résultats.
Tout d’abord, plusieurs étapes du séquençage lui-même « parasitent » la fiabilité du résultat final. Il faut savoir extraire correctement l’ADN, le découper en morceaux puis séquencer ces derniers à l’aide de diverses plateformes et méthodes. Or, ces plateformes et méthodes sont assez différentes les unes des autres, tant en termes de limites que de fiabilité de résultats [14].
Il faut ensuite lire ces résultats en tentant de remettre bout à bout les séquences lues pour reconstituer le génome en entier. Puis, les séquences obtenues sont comparées avec d’autres considérées comme « de référence » et stockées dans des bases de données qui contiennent déjà elles-mêmes des erreurs [15].
Autant d’étapes qui introduisent une importante imprécision dans les résultats finaux de détection d’effets non intentionnels et donc d’évaluation des risques, les incertitudes quant aux séquences augmentant avec des génomes polyploïdes ou aux nombreuses séquences répétées [16]. Sans compter qu’en bout de course, les mutations repérées peuvent ne pas s’avérer de la même importance biologique [17]…
De nombreux articles résument les difficultés rencontrées à chaque étape, comparent les méthodes, plateformes [18] et logiciels associés [19], discutent de normes de référence (« gold standards ») et normes à mettre en place pour fiabiliser le processus complet [20]. Bref, comme le soulignent ces auteurs, autant de techniques et d’étapes qui sont en cours d’amélioration car non parvenues à maturité, en pleine évolution et nécessitant donc nombre de vérifications pour des évaluations au cas par cas.
Selon de nombreux chercheurs, savoir faire face à l’accumulation de très nombreux résultats (un de ces fameux « big data »), dont certains avec de multiples erreurs, et les utiliser avec rigueur est un des défis de la biologie moléculaire actuelle. D’ailleurs, devant le scepticisme soulevé face à tout résultat de séquençage, les demandes minimales des relecteurs d’articles scientifiques sont telles que de plus en plus de chercheurs sont maintenant obligés de présenter des résultats de séquençages de plus longues séquences pour assurer du sérieux de leurs résultats bruts [21].
Nous avons, au cours de cet article, évoqué les mutations et épimutations parmi les effets non intentionnels de ces biotechnologies modernes. On peut dès lors observer que prétendre détecter et éliminer tous les effets non intentionnels des nouvelles techniques relève plus de l’acte de foi que de la science établie. Surtout, face à ce constat des effets potentiels, des limites du rétrocroisement et de celles du séquençage, on peut douter en toute bonne foi de la capacité des sélectionneurs à éliminer tous les effets hors-cible puis à détecter efficacement et rapidement les mutations et épimutations restantes par séquençage. On peut dès lors s’étonner du silence du Comité scientifique du Haut Conseil des Biotechnologies (HCB) sur tous ces points dans son premier rapport publié en février 2016 sur les impacts liés aux nouvelles techniques de modification génétique.
Eric Meunier, Inf’OGM
[1] « Stress induces plant somatic cells to acquire some features of stem cells accompanied by selective chromatin reorganization », Florentin, A. et al. (2013), Developmental Dynamics, 242(10), 1121-1133 ;
« Developmental stage specificity and the role of mitochondrial metabolism in the response of Arabidopsis leaves to prolonged mild osmotic stress », Skirycz, A. et al., (2010). Plant Physiology, 152(1), 226-244 ;
« Arabidopsis mesophyll protoplasts : a versatile cell system for transient gene expression analysis », Yoo, S.-D.et al. (2007). Nat. Protocols, 2(7), 1565-1572.
[2] « Cell culture-induced gradual and frequent epigenetic reprogramming of invertedly repeated tobacco transgene epialleles », Krizova, K. et al., (2009). Plant Physiology, 149(3), 1493-1504 ;
« Extended metAFLP approach in studies of tissue culture induced variation (TCIV) in triticale », Machczyńska, J. et al., (2014). Molecular Breeding, 34(3), 845-854 ;
« Tissue culture-induced novel epialleles of a Myb transcription factor encoded by pericarp color1 in maize », Rhee, Y. et al., (2010). Genetics, 186(3), 843-855 ;
« Transformation-induced mutations in transgenic plants : analysis and biosafety implications », Wilson, A.K. et al., (2006). Biotechnol Genet Eng Rev, 23(1), 209-238 ;
« A whole-genome analysis of a transgenic rice seed-based edible vaccine against cedar pollen allergy », Kawakatsu, T. et al., (2013).. DNA Research 20, 623-631 ;
« Recent progress in the understanding of tissue culture-induced genome level changes in plants and potential applications », Neelakandan et al.,, 2012,. Plant Cell Reports, 31(4), 597-620
[3] « Meiotic transmission of epigenetic changes in the cell-division factor requirement of plant cells », Meins, F. et al., (2003). Development, 130(25), 6201-6208.
[4] « Cell biology : delivering tough cargo into cells », Marx, V. (2016). Nat Meth, 13(1), 37-40.
[5] « Only half the transcriptomic differences between resistant genetically modified and conventional rice are associated with the transgene », Montero, M. et al., (2011). Plant Biotechnology Journal, 9(6), 693-702.
[6] Rapport du CS du HCB, page 50
[7] « Less is more : strategies to remove marker genes from transgenic plants », Yau, Y.Y. et al, (2013), BMC Biotechnology.
[8] « Alternatives to Antibiotic Resistance Marker Genes for In Vitro Selection of Genetically Modified Plants – Scientific Developments, Current Use, Operational Access and Biosafety Considerations », Breyer et al (2014) Critical Reviews in Plant Sciences, Vol 33, Issue 4, 286-330
« Suitability of non-lethal marker and marker-free systems for development of transgenic crop plants : present status and future prospects », Manimaran et al (2011) Biotechnol Adv. 29(6), 703-14
« Effects of antibiotics on suppression of Agrobacterium tumefaciens and plant regeneration from wheat embryo », Han, S-N. et al, (2004), Journal of Crop Science and Biotechnology 10, 92-98.
[9] Certains de ces systèmes peuvent persister comme éléments circulaires extra-chromosomiques durant plusieurs générations (ex. du blé).
[10] utilisables en identification (ex : empreinte d’excision de transposon, recombinaisons) de l’évènement de transformation
[11] Biotechnology 13., ibid.
[12] « Recent progress in the understanding of tissue culture-induced genome level changes in plants and potential applications », Neelakandan, A.K. et al, (2012), Plant Cell Reports 31, 597-620
« Regeneration in plants and animals : dedifferentiation, transdifferentiation, or just differentiation ? », Sugimoto, K. et al, (2011), Trends in Cell Biology 21, 212-218.
[13] « Distorsions de ségrégation et amélioration génétique des plantes (synthèse bibliographique) », Diouf, F.B.H. et al , (2012), Biotechnologie Agronomie Société Et Environnement, 16(4), 499-508
« Quantitative trait locus mapping can benefit from segregation distortion », Xu, S. (2008), Genetics, 180(4), 2201-2208
« Genetic map construction and detection of genetic loci underlying segregation distortion in an intraspecific cross of Populus deltoides », Zhou, W et al, (2015), PLoS ONE, 10(5), e0126077
[14] « Next generation sequencing technology : Advances and applications », Buermans, H.P.J. et al, (2014), Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease, 1842(10), 1932-1941
« Next-generation sequencing platforms », Mardis, E.R. (2013), Annual Review of Analytical Chemistry, 6(1), 287-303
« Applications of next-generation sequencing. Sequencing technologies – the next generation », Metzker, M.L. (2010), Nature Reviews Genetics, 11(1), 31-46.
[15] « Next-generation sequence assembly : four stages of data processing and computational challenges », El-Metwally, S. et al, (2013), PLoS Comput Biol 9, e1003345
« Systematic comparison of variant calling pipelines using gold standard personal exome variants », Hwang, S. et al, (2015), Scientific reports 5, 17875
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« Theoretical analysis of mutation hotspots and their DNA sequence context specificity », Rogozin, I.B. et al, (2003), Mutation Research/Reviews in Mutation Research 544, 65-85
[16] « Sequencing technologies and tools for short tandem repeat variation detection », Cao, M.D. et al, (2014), Briefings in Bioinformatics
[17] « Open chromatin reveals the functional maize genome », Rodgers-Melnick, E. et al, (2016). Proceedings of the National Academy of Sciences 113, E3177-E3184
« Evolutionary patterns of genic DNA methylation vary across land plants », Takuno, S. et al, (2016), Nature Plants 2, 15222.
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« Principles and challenges of genome-wide DNA methylation analysis », Laird, P.W. (2010), Nature Reviews Genetics 11, 191-203
« Performance comparison of whole-genome sequencing platforms », Lam, H.Y.K. et al (2012), Nat Biotech 30, 78-82
« Low concordance of multiple variant-calling pipelines : practical implications for exome and genome sequencing », O’Rawe, J. et al, (2013), Genome Medicine 5, 1-18.
[19] « Next-generation sequence assembly : four stages of data processing and computational challenges », El-Metwally, S. et al, (2013), PLoS Comput Biol 9, e1003345
[20] « Rapid evaluation and quality control of next generation sequencing data with FaQCs », Lo, C.-C. Et al, (2014), BMC Bioinformatics 15, 1-8
[21] « Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing », Lan, F. et al, (2016), Nat Commun 7
